E. S. P. O. CH
ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
Aldaz Alex alexchristopheraldaztoala@gmail.com
6to Semestre
RIOBAMBA – ECUADOR
OBTENCIÓN DE CASEÍNA
2. OBJETIVOS:
2.1 General:
- Aislar caseína a partir de la acidificación de la leche.
2.2 Específicos:
- Separar la caseína de la solución lechosa y lavarla.
3. MARCO TEÓRICO
CASEÍNA
La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y vitaminas A, D y K), minerales (calcio, potasio, sodio, fósforo y metales en pequeñas cantidades), proteínas (incluyendo todos los aminoácidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lípidos. Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C. Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y fibrosas.
Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lactoalbúminas y lacto globulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico.
En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida. La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se añade la para - k - caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela. Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.
Figura 1: reacción entre la fosfoproteínas y el ion calcio
La para - k - caseína, sin embargo, tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella. También tiene todos sus residuos de serina y treonina con sus correspondientes grupos hidroxilo, así como los carbohidratos dispuestos en una sola cara de su superficie por lo que esta parte exterior es fácilmente soluble en agua gracias a los grupos polares que posee. La otra parte de su superficie se une fácilmente a las alfa y beta caseína insolubles, lo que da lugar a la formación de la micela.
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita
Ca2+ Caseinato + 2HCl Caseína + CaCl2
La conformación de la caseína es similar a las proteínas desnaturalizadas globulares. El alto número de residuos de prolina en la caseina causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes disulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insolubles en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico.
4. PROCEDIMIENTO:
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 RESULTADOS
5.1.1 Resultado Práctico
Preparación una solución de caseinato de sodio, tomando aproximadamente 1 g de caseína en 50 ml de agua destilada y adicionando poco a poco 5 ml de NaOH 1N.
5.2 DISCUSIÓN:
Se logró obtener caseína a partir de la acidificación de la leche misma que se dejó durante varios días en reposo para así de esta manera obtener una mejor consistencia de la misma para posteriormente separar la misma de la solución lechosa; es importante también observar que al separar la mezcla de caseína con etanol se obtiene una caseína con mayor grado de pureza.
6. CONCLUSIÓN:
- Realizada esta práctica, mediante el lavado de la caseína, primero con agua y luego con etanol se logró separar el líquido de la caseína, después en la centrifugadora se elimina el ácido acético (vinagre); razón por la cual precipita la caseína de la leche.
7. BIBLIOGRAFÍA:
Marco Teórico
REACCIÓN DE BIURET
2. OBJETIVOS:
2.1 General:
- Estudiar la prueba de Biuret y sus características en presencia de la caseína
2.2 Específicos:
- Identificar el carácter proteico de la caseína, mediante la formación de un complejo violeta.
- Comprobar la presencia de enlaces peptídicos en la estructura de la caseína.
3. MARCO TEÓRICO
INTRODUCCIÓN
El enlace peptídico es un enlace covalente entre el grupo amino (–NH2) de un aminoácido y el grupo carboxilo (–COOH) de otro aminoácido. Los péptidos y las proteínas están formados por la unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. El enlace peptídico implica la pérdida de una molécula de agua y la formación de un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido.Podemos seguir añadiendo aminoácidos del péptido, pero siempre en el extremo COOH terminal. Para nombrar el péptido se empieza por el NH2 terminal por acuerdo. Si el primer aminoácido de nuestro péptido fuera alanina y el segundo serina tendríamos el péptido al anil-serina. (1)
El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias de composición desconocida. Está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6·4H2O). El reactivo,de color azul, cambia a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de cadena corta.
El Hidróxido de Potasio no participa en la reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. Se usa normalmente en el ensayo de Biuret, un método colorimétrico que permite determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopía ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar el ión Cu2+).
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.
Figura 1: Reacción de Biuret
Sobre la reacción de Biuret
La reacción de Biuret, es un método que detecta la presencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para todas las proteínas y péptidos cortos.
El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del péptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia, tornándose VIOLETA. Mientras más cantidad de proteína está presente en la solución, más oscuro es el color.
4. Procedimiento
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 RESULTADOS
5.1.1 Resultado Práctico
Se torna de un color violeta por el reactivo de Biuret.
5.2 DISCUSIÓN:
En la presente práctica se observó que la reacción de Biuret fue positiva con la solución de caseína la cual tomó una coloración violeta indicando la presencia de enlaces peptídicos y por ende la de proteínas. Sin embargo la coloración de la misma demostró una concentración baja de proteína, observando también que al no agitar correctamente la muestra la coloración de la misma no resultó con una tonalidad mucho más intensa.
6. CONCLUSIONES:
- Habiendo llevado a cabo esta práctica se pudo comprender que cuando una proteína (caseína) se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada Biuret; ya que sus uniones peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo formando así un complejo de color violeta (se necesitan 2 ó más uniones peptídicas para que se forme el complejo coloreado).
- Se pudo identificar que la caseína al ser un conjunto de proteínas fosforadas, además de representar el 80% del contenido proteico en la leche, tiene una respuesta positiva frente a la reacción de Biuret; ya que la misma es una prueba general para proteínas, razón por la cual se torna de una coloración violeta.
7. BIBLIOGRAFÍA
Marco Teórico
PUNTO ISOELÉCTRICO
2. OBJETIVOS:
2.1 General:
- Realizar la precipitación de la caseína por efecto del Punto Isoeléctrico.
2.2 Específicos:
- Comprender la causa de la neutralización de la caseína.
- Determinar el punto isoeléctrico de la caseína, mediante el uso de un ph-metro.
- Comprobar si el precipitado puede disolverse, a través de la adición de NaOH (1N).
3. MARCO TEÓRICO
PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas juegan un papel importante crucial en casi todos los procesos biológicos, tales como catálisis, y transporte, movimiento coordinado, excitabilidad y control de crecimiento y diferenciación, entre otros.
La caracterización de las proteínas es importante debido a que el conocimiento de sus propiedades permite, entre otras cosas, poder manipularlas y darles un uso práctico. Existen varias técnicas para caracterizar las proteínas en base a su peso, carga, interacción con otros compuesto. Por ejemplo, el enfoque isoeléctrico (determinación del punto isoeléctrico) y la cromatografía por intercambio iónico, parte de su principio está basado en la carga de las proteínas. La carga de las proteínas puede ser manipulada por cambios de pH. El punto isoeléctrico (pI) es el pH en que la carga neta total de una molécula es igual a cero y no migra en un campo eléctrico. Un fenómeno físico importante es que cuando una molécula está en su punto isoeléctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio importante de separación de proteínas. Si se quiere determinar con exactitud el pI de una proteína se usa frecuentemente enfoque isoeléctrico, en el cual se usa un gradiente de pH creado por anfolinas. Sin embargo, esta técnica resulta costosa y es casi de uso exclusivo para los laboratorios de investigación. Por otro lado, si se conoce la secuencia de una proteína existen programas que permiten conocer el punto isoeléctrico, tales como el EditSeq de DNA star. Ya que una proteína precipita en su punto isoeléctrico, en esta práctica determinaremos el punto isoeléctrico aproximado de la caseína (proteína mayoritaria en la leche) al colocarlos en soluciones con diferentes valores de pH.
PRECIPITACIÓN POR PUNTO ISOELÉCTRICO
Precipitación por punto isoeléctrico (IEF, siglas en inglés) es un método electroforético para la separación de proteínas, de acuerdo a su punto isoeléctrico, en un gradiente de pH estable. El método consta de una capa de soporte (usualmente un gel de poliacrilamida, pero también puede usarse agarosa) que contiene una mezcla de anfolitos (ácidos polyamino-policarboxílico sintéticos).
Cuando un campo eléctrico es aplicado al gel, los anfolitos se auto ordenan de acuerdo a su punto isoeléctrico desde el ánodo hasta el cátodo. Cada anfolito mantiene un pH local correspondiente con su punto isoeléctrico y este pH uniforme se expresa en capas en el gel. Si una proteína es depositada en un extremo del gel, esta migrará bajo la influencia del campo eléctrico hasta que encuentre la región de pH que le corresponde a su punto isoeléctrico. A este punto la proteína tendrá carga neta y quedará “estacionada” en ese lugar.
En esta técnica las proteínas son separadas de acuerdo a su carga.
¿Qué es el punto isoeléctrico?
El punto isoeléctrico es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa.
Está relacionado con la solubilidad debido que al alcanzar el punto isoeléctrico comienza la precipitación. El punto isoeléctrico de la caseína es de pH=4,6.
Reversibilidad del precipitado insoluble a soluble
Precipita cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la caseína también se le suele denominar proteína insoluble de la leche la caseína se encuentra en su punto de menor solubilidad debido a la reducción de las repulsiones intermoleculares.Los iones H+ y OH- provocan efectos desnaturalizadores sobre la envoltura acuosa de las proteínas afectando la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Al agregar una sustancia ácida como HCl a la leche, se provoca una alteración sobre la carga superficial de las caseínas, eliminando las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura y finalmente provocando su precipitación, formando una cuajada poco mineralizada lo que precipitan, pero también se puede solubilizar si se le adiciona una base como es el NaOH de concentración 1N. La relación que existe es que si el pH se encuentra por debajo o encima del Punto Isoeléctrico, la proteína tenderá a ser soluble.
4. PROCEDIMIENTO
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 RESULTADOS
5.1.1 Resultado Práctico
Medición del pH. Punto isoeléctrico de la caseína.
➔ La caseína es la unica proteina de la leche que alcanza su punto isoeléctrico a un valor de 4,8.
5.2 DISCUSIÓN:
Se verificó que el ácido acético contenido en el vinagre desnaturaliza las proteínas de la leche (caseína y proteínas séricas) y por acción de la centrifugación se separa la parte sólida de la líquida. Observando qui una reacción irreversible al colocar el ácido acético en la caseina, esta se torna insoluble en el agua sin embargo al colocar hidróxido a la misma la reacción se torna reversible; es decir se solubiliza en agua.
6. CONCLUSIONES:
- Se pudo comprender que la neutralización de la caseína, se debe básicamente a la adición del ácido acético (1N); debido a que el mismo provoca la salida del Calcio de la micela, desestabilizando a la caseína y formándose de esta manera un gel neutro.
- Llevada a cabo esta práctica se pudo determinar que el punto isoeléctrico de la caseína tiene un valor de 4,8.
- La caseína es insoluble en: debido a su pH ácido y al comportamiento anfótero del agua pero se dispersa o solubiliza bien con una base fuerte NaOH ya que con su carácter básico al mezclarse con la caseína se neutralizan.
7. BIBLIOGRAFÍA:
Marco Teórico
exelente practica es una manera practica de ver la presencia de proteinas en alimentos con solucion de Biuret,
ResponderBorrarEstoy interesado en estudiar quesos y su factibilidad con leche en polvo. En ellos pareceria que la caseina no polimeriza bien. No se si es que la caseina se deteriora en el proceso de la leche en polvo o si el emulsionante actua COMO INHIBIDOR DE LA POLIMERIZACION. POSEE ALGUNA INFORMACION AL RESPECTO. DESDE YA MUCHAS GRACIAS.
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